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?RIPA裂解液的原理解析


RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)對動物細(xì)胞胞膜、胞漿、胞核成分均有較強(qiáng)裂解作用,RIPA裂解液裂解得到的蛋白樣品可以用于常規(guī)的Western、IP等。
RIPA裂解液的原理如下。
RIPA主要是從動物組織和動物細(xì)胞中抽取的可溶性蛋白。RIPA 組織/細(xì)胞裂解液是利用表面活性劑等來裂解細(xì)胞膜(包括核膜)。
索萊寶高校RIPA裂解液的使用方法
如發(fā)現(xiàn)RIPA有沉淀,請放室溫半小時或者常溫水浴使沉淀溶解。 
根據(jù)使用量,取每1ml RIPA 加入10ul PMSF,使PMSF的最終濃度為1mM。混勻備用 (PMSF現(xiàn)用現(xiàn)加)。 

1、樣品前處理: 
a)對于貼壁細(xì)胞:去除培養(yǎng)液,用 PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。按照 6 孔板每孔細(xì)胞量加入150-250 ul裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下,使裂解液和細(xì)胞充分接觸。 
b)對于懸浮細(xì)胞:離心收集細(xì)胞,用手指把細(xì)胞用力彈散。按照 6 孔板每孔細(xì)胞量加入 150-250 ul 裂解液的比例加入裂解液,再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。如果細(xì)胞量較多,必需分裝成50-100萬細(xì)胞/管,然后再裂解。 
c)對于組織樣品: 把組織剪切成細(xì)小的碎片。按照每20mg組織加入150-250 ul裂解液的比例加入裂解液。 (如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液,如果需要高濃度的蛋白樣品,可以適當(dāng)減少裂解液的用量)。
用玻璃勻漿器勻漿,直至充分裂解。 
2、后處理: 
將裂解后的樣品10000-14000g離心3-5分鐘,取上清,即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。 
注意事項 : 
強(qiáng)烈型裂解液,可以提取核蛋白,但在提取核蛋白的同時,也會將基因組一并釋放出來,造成細(xì)胞裂解液粘稠,此時可以直接加入蛋白上樣緩沖液,煮沸再離心,離心后直接上樣電泳;若想測定濃度,可入加少量 SDS(1%),煮沸后離心測濃度。本系列蛋白提取試劑所提取的蛋白由于含有去污劑,所以不適合使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒,請選擇BCA法或者Lowry法檢測蛋白濃度。

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